Poctivá práce není zbytečnáCesta ke „čtení“ pšenice byla dlouhá, a když na ni odborníci z Olomouce vyráželi, vůbec netušili, kam až je dovede. Tak to ostatně v dobré vědě bývá, říká šéf týmu Jaroslav Doležel v rozhovoru pro Technet, který můžete najít zde. |
Jak se „neztratit“ v pšenici, vymysleli před několika lety vědci z Ústavu experimentální botaniky AV ČR a olomouckého Centra regionu Haná pro biotechnologický a zemědělský výzkum pod vedením Jaroslava Doležela. Vytvořili postup, který by měl umožnit proniknout do předtím skrytých tajemství pro člověka nejdůležitější rostliny vůbec: pšenice.
V letošním roce spolu s kolegy z celého světa dokázali, že jejich metoda funguje. Jejich práce zdobila první stránku jednoho vydání světově proslulého odborného časopisu Science, do kterého by alespoň jednou za život chtěl napsat článek snad každý vědec s trochou ctižádosti (článek je volně přístupný ve speciální sekci webu Science věnovanému sekvenování pšenice, kterou najdete zde).
Proč se do něj dostali právě vědci z Hané? Vždyť čtení, přesněji sekvenování, dědičné informace je dnes relativně běžné. Živočichů už máme „přečtených“ desítky, bakterií či virů ještě o mnoho víc. V rostlinách ale kupodivu máme velkou mezeru.
Přehrabávání v odpadu
Rostliny mají totiž často v DNA spoustu odpadu. To není básnická licence: „odpadní DNA“ je terminus technicus pro úseky DNA – často velmi dlouhé – u kterých věda neví, zda a případně co přesně v organismu dělají nebo zda jsou to jen postupně bobtnající hluchá místa, která asi neškodí, ale ani neprospívají. Dědičná informace některých rostlin je velká a složitá také díky tomu, že vznikly křížením více druhů, její čtení je tedy obecně obtížnější než u živočichů.
Protože rostliny jsou pro výživu lidstva nepostradatelné a jsou důležitým zdrojem surovin pro různá odvětví průmyslu, museli se vědci pustit i do tohoto úkolu. Zatím však moc nepokročili a u většiny vybraných rostlin přečetli celou dědičnou informaci (genom) jen „nahrubo“. Úplnou dědičnou informaci získali jen u tří druhů. Prvním z nich je plevelná rostlina huseníček rolní, kterou si vybrali, protože má velmi malou dědičnou informaci a protože je oblíbenou rostlinou pro vědecké pokusy (tzv. modelovou rostlinou). Další dva druhy – rýži a kukuřici – už vybrali kvůli jejich významu a také proto, že jejich dědičné informace nejsou příliš velké.
Do poslední ze tří nejdůležitějších zemědělských plodin – pšenice seté – se odborníci pouštěli o něco méně ochotně. Pšenice je rostlina s obrovskou a velmi složitou dědičnou informací. Může za to její vznik postupným křížením tří druhů trav, které proběhlo bez přispění člověka. Ten si ale asi před 10 tisíci lety právě vzniklého druhu všiml a pšenici začal pěstovat. Zmíněná křížení neproběhla úplně standardně, a pšenice si proto zachovala celou dědičnou informaci všech tří rodičů. Výsledkem je asi 17 miliard písmen dědičného kódu v DNA této rostliny, což je asi šestkrát více než má člověk.
Jedna kniha jako druhá
Problémem při „čtení“ pšenice navíc není jen velikost. Protože dědičné informace tří rodičů pšenice si byly navzájem podobné, můžeme si dědičnou informaci naší pšenice zjednodušeně představit tak, že je tvořena třemi různými vydáními stejné knihy (např. ve spisovné češtině, hanáčtině a slovenštině), přičemž každá ze tří knih má sedm kapitol. Tyto „kapitoly“ jsou ve skutečnosti chromozomy, které představují části dědičné informace a každý z nich je tvořený jednou molekulou DNA.
Pšenice se s nadbytkem textu (dědičné informace) naučila žít a zdá se, že to naopak přispělo k její přizpůsobivosti vnějším podmínkám a celosvětovému rozšíření. Pro ty, kteří její dědičnou informaci luští, je to však pohroma. Všechny dosavadní metody sekvenování totiž čtou krátké úseky DNA – „jen“ asi stovky až tisíce písmen dědičného kódu. Vědci proto DNA před sekvenováním štěpí na malé kousky a po jejich přečtení je zpětně skládají do větších úseků. Což v případě pšenice (a nejen jí) vede k velkým obtížím.
Přirovnání dědičné informace ke knize je do jisté míry zavádějící, protože vyvolává pocit, že se genetická informace snadno čte. Ve skutečnosti však kvůli technologii čtení DNA po malých kouscích čteme v případě pšenice naráz tři různá vydání stejné knihy, která předtím prošla skartovačkou. Roztrhání dědičné informace na malé kousky vede k beznadějnému zmatku: je jich obrovské množství a nacházíme pasáže, které se navzájem podobají téměř jako vejce vejci. Počet možných kombinací roste geometrickou řadou a čtení běžnou metodou by bylo nesmírně obtížné a bez záruky, že celou informaci opravdu sestavíme.
Schéma chromozomů pšenice. DNA tvoří 21 chromozomů ve třech sadách, které jsou si velmi podobné. To ale paradoxně kvůli dnes používaným metodám její čtení stěžuje, a ne zlehčuje, jak by se dalo čekat.
Olomoucký tým tento problém vyřešil procesem, který bychom mohli nazvat „krájení genomu pšenice“. Vědci přišli na to, jak od sebe oddělit všech 21 kapitol dědičné informace pšenice (chromozomů). To znamená, že už nemají problém vědět, kterou kapitolu z kterého ze tří vydání knihy právě čtou. Vyžaduje to ale soubor postupů, které vědci postupně a systematicky ladili celé roky. Díky tomu byla jejich metoda nakonec vybrána velkým týmem z několika desítek laboratoří celého světa jako základ světového projektu čtení DNA pšenice.
Klíčem úspěchu je především právě ono rozdělení na „kapitoly“, tedy chromozomy. To zní možná triviálně, ale většina buněk rostlin i živočichů má chromozomy uloženy v jádrech buněk tak, že je od sebe nelze oddělit. Jsou v malé kuličce o velikosti několika tisícin milimetru. I to je důvod, proč se obvykle analyzuje dědičná informace jako celek – rozláme se celá najednou bez ohledu na chromozomy. Protože je ale pšenice tak složitá, badatelé se chtěli tomuto postupu vyhnout. Jak ale chromozomy od sebe oddělit? Existuje jedna chvíle: chromozomy jsou od sebe separované v buňkách, které se právě dělí na dvě dceřiné buňky. Jenže dělících se buněk je v organismu málo, navíc se buňky nedělí naráz všechny na povel.
Začíná se u kořínků
V Olomouci přišli na způsob, jak tohle obejít. Nejvíce dělících se buněk je u rostlin ve špičkách rostoucích kořínků, a tak se zaměřili na ně. Kořínky klíčících semen inkubují v živném roztoku s látkou, která buňkám dovolí dostat se jen do určité fáze před dělením. V koříncích se tak postupně nashromáždí buňky „nadržené“ na dělení.
Když mají vědci pocit, že je ta správná chvíle, roztok vymění za jiný, který už dělení nebrání, a buňky se téměř najednou do něj pustí. Poté se roztok vymění ještě jednou a pomocí jiné chemikálie se dělení zastaví v momentu, kdy jsou chromozomy od sebe separované (v tzv. metafázi). Nakonec se kořenové špičky, ve kterých se téměř každá druhá buňka dělí, rozmixují ve zkumavce a chromozomy se z buněk uvolní do roztoku. Ke vzorku s chromozomy nakonec přidají fluorescenční barvivo, které se váže na DNA chromozomů.
Detail průtokového cytometru, který v rostlinné biologii není až tak běžným přístrojem. Jednotlivé kapičky se přivádí do komory trubičkou nahoře, pak se v elektrostatickém poli rozdělují tak podle toho, zda a případně jaké chromozomy obsahují.
Pak přijde specialita z Hané: izolace chromozomů jednoho po druhém. Používá se k tomu přístroj zvaný průtokový cytometr (to už není ani olomoucký, ani český vynález). Buňky kořínků se rozbijí a vzniklá směs jejich částí, včetně chromozomů, prochází v cytometru tenkou kapilárou rychlostí několik tisíc částic za sekundu a chromozomy jeden za druhým protínají paprsek laseru, který měří jejich optický „otisk“ (vlastně fluorescenci).
Úzký vodní paprsek je hned poté roztřepáván na malé kapky, které jsou buď prázdné, obsahují nějakou část buňky, nebo chromozom (pouze jeden, více se tam nevejde). V elektrostatickém poli jsou kapky s vybraným chromozomem oddělovány od ostatních a sbírány do připravené zkumavky. Tisíce kusů jednoho z 21 chromozomů pšenice jsou připravené ke čtení. Průtoková cytometrie byla původně vyvinuta pro analýzu lidských buněk a ve velkém se využívá v biomedicínském výzkumu i klinické praxi. Tým profesora Doležela byl jeden z prvních na světě, který ji použil v rostlinné biologii.
I když se chromozomy měří rychlostí tisíce za sekundu, dostatek materiálu na sekvenování DNA jednoho chromozomu (jedné „kapitoly“) se i tak připravuje celé hodiny – po předchozí asi týdenní přípravě kořínků a vzorků z nich. Podstatnější ovšem je, že se původně nezvládnutelný úkol – jak naráz přečíst 21 kapitol ze tří vydání jedné knihy – změnil v úkol mnohem zvladatelnější – jak 21krát za sebou sestavit krátké fragmenty textu jedné kapitoly.
Postup má navíc tu výhodu, že DNA každého chromozomu je možné poslat do jiné laboratoře, takže na projektu čtení dědičné informace pšenice může pracovat více laboratoří v různých částech světa, aniž by si zasahovaly do díla. Metoda pilovaná roky v Olomouci se tak stala základem dosud nejambicióznějšího projektu čtení genomu rostlin, který koordinuje Mezinárodní konsorcium pro sekvenování genomu pšenice se sídlem v americké Bethesdě.
